一细胞RNA的提取

1. 在培养板中用PBS液冲洗细胞2次后，加入Trizol裂解细胞，每孔加1ml Trizol（6孔板）.用取样器反复抽吸混匀，再加入糖原250ug（5ul，50ug/ul）混匀。注意：Trizol加量根据培养板面积决定，不是由细胞数决定.如果Trizol加量不足，可能导致提取的RNA中有DNA污染。

2. 将样品在15-30℃放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。

3. 每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s（注意防止液体溅出），室温放置3min。

4. 4℃10000rpm离心10-15min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（约600ul，约为所用Trizol试剂的60%）转移到新管中（注意此步骤是决定RNA纯度的关键）。

5. 在得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇，混匀，on ice放置20min。

6. 4℃13000rpm离心20min，去上清。

7. 加入1ml75%乙醇（DEPC水处理过的水配制）洗涤沉淀。每使用1ml Trizol至少加1ml乙醇。

8.4℃10000rpm离心2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。

9. 室温放置晾干（不要晾得过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干2-3min左右即可）。加入适量DEPC水（根据实验需要，加大约22ulDEPC水）。

10. 取2uL RNA液稀释到100uL至于分光光度计下，分光光度计下计算产量。

11. 计算所需要加入的cDNA反应体系中RNA溶液的体积。

需要注意的几点,

1. 从少量样品中提取RNA(1-10mg组织或10²-10⁴细胞)，加800ul Trizol，后加糖原，糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml时不会影响反转录cDNA第一链的合成，也不影响PCR反应。

2.匀浆后，加氯仿前，样品可在-70℃放置一个月以上。RNA沉淀可以保存在75%酒精中，2-8℃一个星期或-20℃一年以上。如果要长期保存，RNA可以溶解于100%去离子甲酰胺中，-70℃长期保存。

预防RNase污染，应注意以下几个方面：

1. 经常更换新手套，因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。

2. 使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。

3. RNA在Trizol试剂中不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。

4.配制溶液应使用无RNase的水（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至中浓度0.1%(v/v)，放置过夜，高压灭菌。注：DEPC有致癌之可能，需小心操作）。

二反转录

●操作方法

1．反转录反应。

【SYBR Green Assay】

*1 Random 6 mers和Oligo dT Primer同时使用，可有效地将全长mRNA反转录成cDNA。使用单引物进行反转录时，使用量分别如下：

Random 6 mers（100 μM） 2.0 μl（200 pmol）

Oligo dT Primer（50 μM） 0.5 μl（25 pmol）

Specific Primer（2 μM） 0.5 μl（1 pmol）

*2 反应体系可按需求相应放大，10 μl反应体系可最大使用1 μg的Total RNA。

*3 应用Gene Specific Primer时，建议反转录反应条件设置为42℃15min。PCR反应有非特异性扩增时，将温度升到50℃会有所改善。

③ 将得到的RT反应液加入到下一步的Real Time PCR反应体系中，其加入量不要超过Real TimePCR反应体积的1/10（V/V）量。

三Real-Time PCR