试剂和材料：

A．缓冲液和固定剂：

1．含4%的多聚甲醛的PBS（添加镁离子和钙离子）

2．TBS缓冲液含0.05%皂苷250ml

3．TBS缓冲液含1%的BSA，0.05%的皂苷，0.2%的叠氮化钠100ml

4．TBS缓冲液含1%的SDS，0.05%的皂苷100ml

B．封片的工具

C．盖玻片用HCI-Alcohol处理，便于细胞的生长

D．载玻片

E．指甲油（封片用）

1． 细胞的准备

A）弃去6孔板中培养基

B）PBS冲洗细胞

C）用4％多聚甲醛覆盖盖玻片室温30min（固定）

D）快速的去除多聚甲醛，用TBS漂洗培养皿，每次5min

E）去除TBS，添加TBS含1%的SDS，0.05%的皂苷溶液，室温5min

F）去除TBS缓冲液含1%SDS，0.05%皂苷溶液，用TBS缓冲液含0.05%皂苷溶液冲洗培养皿4次，每次5min

2． 封闭步骤：

A）去除TBS/0.05%皂苷溶液后，加入TBS缓冲液含1%BSA，0.05%皂苷，0.2%叠氮化钠溶液覆盖盖玻片，室温封闭30min

3． 一抗

A) 一抗用TBS含1%BSA，0.05%皂苷，0.2%叠氮化钠溶液，按照1：50的比例稀释

B) 标记石蜡膜，这样你就能在石蜡膜合适的地方放置一抗

C) 在先前设计好的石蜡膜的地方放置一滴一抗（20-50ul）

D) 小心的移出盖玻片，用吸水纸吸干盖玻片的边缘

E) 倒置盖玻片，使细胞面朝下，把盖玻片放在一抗中，37℃温育30min

F) 用TBS含1%BSA，0.05%皂苷，0.2%叠氮化钠溶液冲洗3次，每次5min

4．二抗（二抗用TBS含1%BSA，0.05%皂苷，0.2%叠氮化钠溶液，按1:300的比例稀释）

A)在石蜡膜上设计一个地方，滴入二抗，放置盖玻片在二抗中（细胞面朝下），37℃温育30min

B)用TBS含1%BSA，0.05%皂苷，0.2%叠氮化钠溶液冲洗3次，每次5min

C)加封片剂到载玻片上

D）放置盖玻片在封片剂上，使细胞面朝下。