细胞培养 cell culture：是在模拟机体内的生理环境中维持细胞生长、繁殖的技术。

一、设施器材

1.设施：超净台、酒精灯、恒温培养箱、倒置显微镜、液氮储存罐、干燥箱、冰箱、电子天平、恒温水浴槽、离心机、压力蒸汽消毒器。

2.器材：

2.1 传代培养器材：培养瓶、培养皿、玻璃瓶、刻度吸管、离心管、烧杯、量筒、三角烧瓶 、多孔培养板等。

2.2 原代培养器材 ：剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头 、纱布、注射器和针头。

二、培养试剂：

培养基、血清（56℃30min灭活）、0.25%胰酶 、PBS(高压灭菌)。

三、实验步骤

1.原代培养：按不同实验需求方法；

2. 细胞传代培养

2.1准备工作：

1）肥皂洗手，更换培养室专用工作服。在进行无菌操作前，用75% 的酒精擦拭双手，注意指间和指甲周围。同时，用酒精棉球擦拭超净台，

2）将培养液放置室温，备用。

3）打开超净台内的紫外灯，照射30 min。同时，将实验所需材料也放入超净台进行灭菌（血清、培养基除外）

4）倒置显微镜下，观察细胞的状态，是否已经长满培养瓶，需要进行分瓶。

2.2 关闭超净台的紫外灯，打开风机。

2.3 点燃酒精灯，取出刻度吸管，在火焰上略烧，然后，安上吸球待用。

2.4 在打开培养瓶之前，用酒精棉球擦拭瓶盖，打开后，瓶口在酒精灯上过火焰，再用吸管轻轻吸出旧的培养液，注意，吸管不要碰到布满细胞的培养瓶的侧壁。

2.5 用PBS洗细胞2遍，将胰酶加入培养瓶内,显微镜下随时观察，见到细胞变圆时，立即翻转培养瓶，吸出胰酶。记住不要消化时间过长，（约5-10分钟）。

2.6 加入含10%血清的培养基终止消化。用吹打管吹打，一定要轻轻吹打，使其从瓶壁上脱落分散到培养基中，再补加培养基，分装到培养瓶中。然后，用火焰烧培养瓶的瓶口和盖，再盖好培养瓶的盖，放到培养箱中进行培养。

以上介绍的是贴壁细胞的传代培养方法，对于悬浮细胞的传代培养方法，只需要将细胞进行离心，1000 rpm，5 min,然后，换入新的培养基即可。再分装到不同的培养瓶中进行培养。

不健康的细胞质中有空泡，细胞内有颗粒样物质，细胞间空隙增大，变形，不规则，失去原有的特点。

2.7 是否污染：传代或换液24--48 h注意观察细胞是否被污染，污染的细胞培养液变浑浊，镜下可见有大量菌丝。如果细胞生长缓慢，生长特性改变，胞质内颗粒性物质增多，尽管培养液不变浑浊，考虑可能有支原体污染。污染的细胞立即从培养箱中取走，以免污染其它细胞。

3. 细胞冻存与复苏

3.1 为了保证细胞良好的状态，在细胞冻存的前一天使细胞处于对数增长期，同时将细胞换液，次日，按照细胞传代培养方法，用胰酶消化贴壁细胞，将细胞用培养基冲下来，然后，用15 mL离心管离心，1000 rpm，5min，弃上清，收集细胞。

3.2. 加入适量的冻存液（10% DMSO 和 90%细胞培养液）。

3.3 分装到冻存管中，做好标记，标明细胞名称，保存时间，细胞代数等。

3.4 4℃放置30 min；-20℃放置1.5 h； -70℃放置12 h；最后移到液氮罐中长期保存。

4. 细胞的复苏

细胞的复苏原则是快速溶化，因为如果缓慢的溶化，会使进入细胞的水分形成冰晶，对细胞造成伤害，因此，在复苏细胞时，将冻存细胞直接放到装有75%乙醇的37℃水浴中，使其迅速溶解。在超净台内将冻存管内的细胞悬浮液直接加入小培养瓶或培养皿内，然后，加入3 mL的培养液。次日，观察细胞生长情况，并更换细胞培养液。